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domingo, 10 de abril de 2011

Preparación y purificación de las enzimas

Por Perez-Gutierrez, Alejandra
Para fines científicos es importante purificar un preparado de enzimas para llegar lograr extraer las enzimas indeseables. Cada tipo de enzima y tejido requieren un tipo de tratamiento distinto. Algunos métodos que se utilizan son la precipitación fraccionada, la diálisis y la precipitación mediante el calentamiento moderado, con algún acido o con concentraciones de alcohol o acetona. (1L)

Para la realización de la pureza de una enzima es necesario realizar la técnica de purificación de una proteína algunas de estas son: el análisis por ultracentrífuga, el electroforético y otros pero se debe tomar en cuenta que durante este transcurso se llegan a perder gran parte de ella.

También este se puede realizar mediante el sometimiento de la enzima a fraccionamientos sensitivos como en el caso de la electroforesis en gel de almidón o de acrilamida y así demostrar que la enzima como tal está compuesta por varias proteínas, y que algunas presentan la misma actividad enzimática pero a causa de la sus estructuras y propiedades distintas se les consideran isoenzimas. (2)

En general, la absorción de una encima es fácil debido específicamente, por su sustrato, de manera que este sea insoluble en la solución de la enzima empleada. Tal noción no ah tenido una gran practica, tal vez a causa de que la enzima se libera de una manera constante en relación de la descomposición del sustrato. A pesar de todo, recientemente se ah realizado con gran éxito la absorción de amilasa por almidón en una solución que contiene tanto alcohol 40% que la enzima es inactiva en ella. (1L)

Es importante dividir el tejido para sacar de él las enzimas de las células que contiene por medio de un homogeneizador, un tratamiento muy enérgico lo comprende la molienda de tejido con arena realizando vibraciones ultrasónicas, congelamiento y descongelamiento, la autolisis entre otros.

Uno de los procedimientos para la purificación de enzimas es la absorción, estas al igual que otras proteínas son absorbidas muy fácilmente por sustancias inorgánicas como los hidróxidos férrico y alumínico coloidales. La sustancia absorbida se lava ya sea con agua o con una sal apropiada para poder llegar a eliminar más impurezas y por último la enzima es separada de su absorbente por elución con álcali diluido o con alguno que reacciones con la superficie del absorbente. (1)

Por la agitación del tejido triturado en agua, se extraen de la célula la enzima, esta también puede ser extraída de células libres por repetidas congelaciones y descongelaciones. Luego de realizar este procedimiento se realiza el fraccionamiento con sulfato amónico. 
El cual es realizado de la siguiente manera: Algunas son precipitadas por concentraciones bajas de sal en cambio otras se encuentran en solución, de tal modo que si se aumenta lentamente su concentración de sal y aislando cada u
no del precipitados se puede obtener pureza.(2)


La diálisis elimina las sales e impurezas de bajo peso molecular de las enzimas, la solución de la enzima se encuentra dentro de una bolsa semipermeable que es sumergida en a
gua o en una solución tampón.


La purificación de las enzimas se realiza a una baja temperatura para así disminuir la perdidas por desnaturalización en algunos casos esta puede ser calentada durante unos minutos más sin embargo este no tendrá ningun pérdida de su actividad enzimática. Existe también el proceso de electroforesis que consiste en la aplicación de un campo eléctrico a la solución. (2)

La precipitación de las enzimas es un proceso de purificación de las enzimas el cual requiere de muchos procedimientos. Como el cambio de pH el cual remueve las nucleoproteínas y el material grueso, con este, es posible continuar con los demás pasos. Con la utilización de la temperatura en muchos casos ocurre la desnaturalización el material proteico inactivo. En diversos casos se utilizan solventes orgánicos como lo son el etanol, el sustrato de amonio, por lo que se podría trabajar en altas concentraciones por lo cual no ataca su estructura. (2)


La absorción Fraccional es de gran utilidad por que permite la absorción de la enzima y luego desprenderla del material de una forma más pura. Esta es agregada a un material activo en donde la enzima es fijada, esta es lavada con soluciones de sales las cuales son recogidas en fracciones de volumen en donde alguna porción la enzima sale de una forma más pura. (2)

Se encuentra la Cristalización, este procedimiento debe repetirse varias veces debido a que los primeros cristales algunas veces suelen estar contaminados con otras enzimas. Esto demuestra que la obtención de cristales no es 100% pura es solo la repetición de este procedimiento es el que garantiza que se da la pureza.

Para saber exactamente si en se da la pureza absoluta existen otros prosesos que pueden obtenerse por medios fisicos como los son la electroforesis, sedimentacion en ultrafuga, la cromatografia y la determinaciones de solubilidad.
Aun sabiendo que las propiedades de las enzimas pueden llegar a ser muy diferentes es necesario tener preparaciones puras para poder hacer el estudio completo de su actividad. Hoy en día se ah llegado a cristalizar o purificar de una manera correcta, cerca de unas 200 enzimas, y es posible que en unos años más, esto llegue a aumentar considerablemente. (2)









Bibliografia:

1) Enciclopedia de Tecnología Química. (1962)Enzimas, México D.F , Editorial H-A.

2) Enciclopedia Saluat de la Ciencia y la Tecnología. (1964)Enzimas . Barcelona, Primera Edicion.
Referencia:
 

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